离心机使用步骤和离心机使用注意事项

离心机是借离心力分离液相非均一体系的设备。根据物质的沉降系数、质量、密度等的不同,应用强大的离心力使物质分离、浓缩和提纯的方法称为离心。一般说,  
离心机转速在20 000r/min以上的称为超速离心。离心技术,特别是超速离心技术是分子生物学、生物化学研究和工业生产中不可缺少的手段。   
1924年T.Svedberg和Rinde研制出**上台涡轮超速离心机以来,发展非常迅速,现在已广泛地应用到科学研究和生产的各个**域。现在离心机转头高转速已达100000 r/min,大离心力达700 000 g。   
离心机作为一种手段,具有许多优点。例如,超速离心可在低温下操作,保护了生物大分子的活性。制备型的离心机负载量大,一次可分离提纯几克样品,比层析、  
电泳上的样品量大得多。分析离心机不仅可测物质的分子量,还可检验物质的纯度、构象、沉降系数等。因此离心技术在生物学研究中占有重要的地位,是分离、纯  
化细胞、病毒、蛋白、核酸和酶的方便有效的工具。   
(二) 离心原理   
当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时,由于重力场的作用使得悬浮的颗粒逐渐下沉。粒子越重,下沉越快,反之密度比液体小的粒子就会上浮。微粒在重力场下移  
动的速度与微粒的大小、形态和密度有关,并且又与重力场的强度及液体的粘度有关。象红血球大小的颗粒,直径为数微米,就可以在通常重力作用下观察到它们的  
沉降过程。   
此外,物质在介质中沉降时还伴随有扩散现象。扩散是无条件的的。扩散与物质的质量成反比,颗粒越小扩散越严重。而沉降是相对的,有条件的,要受到外力  
才能运动。沉降与物体重量成正比,颗粒越大沉降越快。对小于几微米的微粒如病毒或蛋白质等,它们在溶液中成胶体或半胶体状态,仅仅利用重力是不可能观察到  
沉降过程的。因为颗粒越小沉降越慢,而扩散现象则越严重。所以需要利用离心机产生强大的离心力,才能迫使这些微粒克服扩散产生沉降运动。离心就是利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力,加快液体中颗粒的沉降速度,把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开。离心力(F)的大小取决于离心转头的角速度(ω,r/min)和物质颗粒距离心轴的距离(r,cm)。它们的关系是:F=ω2R   
为方便起见,F常用相对离心力也就是地心引力的倍数表示。即把F值除以重力加速度g (约等于9.8m/s2.)得到离心力是重力的多少倍,称作多少个g。例如离心机转头平均半径是6cm,当转速是60 000   
r/min时,离心力是240 000×g,表示此时作用在被离心物质上的离心力是日常地心引力的24万倍。   
因此,转速r/min和离心力g值之间并不是成正比关系,还和半径有关。同样的转速,半径大一倍,离心力(g值)也大一倍。转速(r/min)和离心力(g值)之间的关系可用下式换算:   
式中:r为半径(cm),g为离心力(g值)   
(三)超速离心机的离心方法  
用离心方法分离生物大分子和亚细胞物质的基本原理是根据它们在液体介质中或者沉降速度不同而形成不同的区带,或者它们的密度  不同而停留在液体介质中不同的位置而把它们一一分开。前者是沉降速度法,应用该法时液体介质的大密度要小于样品中小颗粒的密度,离心时选用高转速和短  时间;后者是沉降平衡法,应用该法时液体介质的大密度要大于样品中小颗粒的密度,离心时选用较低转速和较长时间。实际操作有几种形式:   
1.差速离心 这种方法是选择不同转速的离心,分别分离各个不同组分。例如先用低速沉降大颗粒和上清液,在高速离心上清沉降中等颗粒,后超速离心上清沉降小颗粒。采用逐级提高离心力分离上情液的方法,把不同大小的颗粒分开。   
这种方法比较简单,方便。分离的组份沉到管底,因此可以迅速浓缩所要的组份,减少体积。但回收率和纯度是有矛盾的,要提高回收率,势必提高转速或延长离心时间,这样大小相近的颗粒也会沉到管底。因此该法多用于粗提纯或初步浓缩样品。   
2.速度区带(或速度梯度)离心 本法是将样品放在一个连续的密度梯度液体上,通过离心,大颗粒沉降快,小颗粒沉降慢。经过一段时间,相同的颗粒就在同一深度  
形成一条带子,因此把各种组份分开来。它适用于分离密度相同、而大小不同的物质,如不同的蛋白质组份密度都差不多,但分子量不一样,用本法很容易将其分  
开。但对密度不同、大小类似的物质则不易分离。蔗糖梯度是一种常用的介质。用不同浓度的蔗糖溶液(5%-60%)配成梯度,用于梯度离心。再分别进行收集处于不同区带里的各个组份 
目前,实验室常用的是电动离心机。 
电动离心机转动速度快,要注意安全,特别要防止在离心机运转期间,因不平衡或试管垫老化,而使离心机边工作边移动,一致从实验台上掉下来,或因盖子未盖,离心管因振动而破裂后,玻璃碎片旋转飞出,造成事故。因此使用离心机时,**注意以下操作。  
(1)离心机套管底部要垫棉花或试管垫。  
(2)电动离心机如有噪音或机身振动时,应立即切断电源,即时排除故障。  
(3)离心管**对称放入套管中,防止机身振动,若只有一支样品管另外一支要用等质量的水代替。  (4)启动离心机时,应盖上离心机顶盖后,方可慢慢启动。  
(5)分离结束后,先关闭离心机,在离心机停止转动后,方可打开离心机盖,取出样品,不可用外力强制其停止运动。  
(6)离心时间一般1~2分钟,在此期间,实验者不得离开去做别的事。 
一、凝胶电泳实验注意事项 
1. 琼脂糖:不同厂家、不同批号的琼脂糖,其杂质含量不同,影响DNA的迁移及荧光背景的强度,应有选择地使用。 
2. 凝胶的制备:凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致,溶解的凝胶应及时倒入板中,避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡,以免影响电泳结果。 3. 电泳缓冲液:为保持电泳所需的离子强度和pH,应常更新电泳缓冲液。 
4. 样品加入量:一般情况下,0.5cm宽的梳子可加0.5μg的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定。当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚辩认不清;反之则应适当减少加样量,但是上样量过多会造成加样孔超载,从而导致拖尾和弥散,对于较大的DNA此现象更明显。 
5. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率,平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度,迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子,制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。